Estudando bactéria causadora da leptospirose, pesquisador do Butantan vence Prêmio Tese Destaque da USP na categoria multidisciplinar

O pesquisador Luís Guilherme Virgilio Fernandes, 30, que faz pós-doutorado no Instituto Butantan, foi o vencedor da categoria Multidisciplinar no Prêmio Tese Destaque USP 2019, cuja cerimônia de entrega acontece no dia 13 de setembro.

Orientado pela pesquisadora do Instituto Butantan Ana Lucia Tabet Oller do Nascimento (do Laboratório Especial de Desenvolvimento de Vacinas – Centro de Biotecnologia), Luís Guilherme estudou o comportamento da leptospira, bactéria causadora da leptospirose, doença considerada negligenciada no mundo e que tem alto índice de letalidade, levando a óbito até 40% dos pacientes que desenvolvem sua forma mais grave. A doença é conhecida por apresentar aumento no número de casos em épocas chuvosas, já que pode ser transmitida pelas águas das enchentes e poças infectadas pela urina de ratos contaminados com a leptospira.

A tese vencedora do Prêmio é a “Caracterização da Interação de Leptospira Interrogans com o Sistema Protombina/Trombina e Possíveis Implicações na Virulência”. Com ela, o pesquisador tentou entender melhor um dos sintomas clássicos da forma severa da leptospirose: as hemorragias. 

Nesta entrevista ao Butantan Notícias, ele e sua orientadora falam sobre como o estudo foi feito e sobre sua importância. Os resultados apontaram para uma possível terapia com anti-inflamatórios para tratar os pacientes que manifestam hemorragias. 

Luís Guilherme vem de uma família de Pirajuí, cidade de 23 mil habitantes, na região de Bauru (no Oeste Paulista). Formado em Biotecnologia pela UFSCar, campus de Araras, o pesquisador está no Instituto Butantan desde julho de 2010, quando começou a estagiar, ainda durante a graduação. Com passagem de seis meses pelo Instituto Pasteur, em Paris, o pesquisador já almeja continuar seu pós-Doutorado fora do Brasil. 

 

Butantan Notícias – Luís Guilherme, explique um pouco sobre como foi este estudo feito sobre a leptospira, a bactéria que causa a leptospirose:

Luís Guilherme Virgilio Fernandes - No laboratório, nós estudamos a leptospirose, que é causada pelas bactérias leptospiras e que é uma doença que pode se manifestar de diversas maneiras. Pode haver sintomas mais brandos _uma febre, uma dor muscular, uma dor de cabeça_ ou mais severos, como o sangramento, a hemorragia. Não se sabe exatamente quais são os fatores que causam essas hemorragias e no laboratório, nós começamos a explorar alguns aspectos nessa linha de interação entre bactérias e moléculas do sistema de coagulação, que é o sistema que faz a gente parar de sangrar. Então, por exemplo, quando temos um corte, o sistema de coagulação age para formar um tampão. Começamos a estudar como essas bactérias poderiam prejudicar a formação desse tampão sanguíneo. Neste trabalho, nós testamos diferentes estirpes de leptospira, algumas que causam doença e outras que não causam, para ver como elas conseguiram interagir com uma molécula importante da coagulação, chamada trombina. 

 

BN- E como a bactéria leptospira prejudica a coagulação? 

Luís Guilherme - A coagulação funciona como uma cascata: uma molécula vai ativando a outra e, no final, você tem a formação de moléculas de trombina. A trombina vai agir em uma outra molécula chamada fibrinogênio, que vai formar a fibrina. A fibrina, por sua vez, começa a se agregar e forma o tampão. Então, neste trabalho eu quis ver se as bactérias conseguiam capturar a trombina e impedir que ela agisse sobre o fibrinogênio. Quanto mais virulenta a leptospira, ou seja, quanto mais ela causa doença, maior sua capacidade de capturar a trombina e evitar que ela aja sobre o fibrinogênio. Então, com isso, você tem menos formação desse tampão [e redução na capacidade de coagulação]. 

 

BN – E por que a leptospira faz isso?

Luís Guilherme – Esse mecanismo [de barrar a formação do tampão e o processo de coagulação] facilita a disseminação da bactéria. Quando se tem esse tampão do sangue, que é um coágulo, ele acaba sendo um recurso para evitar que este patógeno [a bactéria] se dissemine para outros tecidos. Então, a leptospira acaba reduzindo esse coágulo para ter sangramento e, com isso, ela consegue atingir novos sítios de infecção. 

 

BN – É um recurso da bactéria para poder expandir sua ação? 

Luís Guilherme - Isso. Nós acreditamos que existam vários outros fatores que contribuam para os distúrbios hemorrágicos. Nós focamos em um, que, provavelmente, é um dos principais, mas sabemos que a infecção é multifatorial. A leptospira tem um arsenal muito grande de proteínas que fazem diferentes funções. Então, no nosso laboratório, existem várias linhas que estudam esses aspectos. No meu doutorado, eu foquei mais na cascata de coagulação. Vimos também, nesse trabalho, que há este efeito direto. Quando a leptospira está no sangue, ela consegue capturar a trombina e consegue evitar a formação de fibrina e, com isso, ela consegue atingir outros tecidos. 

Ana Lucia Tabet Oller do Nascimento – A trombina age no fibrinogênio e forma essa rede de fibrina [tampão]. A leptospira se liga à trombina e impede a formação do coágulo. 

 

BN – E é fácil para a leptospira capturar a trombina quando o processo de coagulação está começando, por exemplo?

Luís Guilherme - A trombina é uma enzima central na cascata de coagulação. Ela é produzida em concentrações muito pequenas no começo. Existe um certo controle e, por isso, o nosso organismo não vai coagular quando não precisar. Quando você tem uma lesão em um vaso sanguíneo, é desencadeada uma sinalização para a cascata de coagulação começar a funcionar e produzir a trombina. Dessa forma, como há pouca trombina no começo, fica mais fácil para a bactéria capturar esse componente. 

 

BN – E qual o impacto disso para o sistema de coagulação? Há um desequilíbrio?

Luís Guilherme – A bactéria leptospira consegue desbalancear toda a cascata de coagulação. Em condições normais, essa cascata fica inerte, mas em uma situação de infecção, para tentar combater um patógeno, o organismo inflama e a inflamação ativa, de forma desenfreada, essa cascata. Então, além do efeito direto da leptospira de capturar a trombina, ainda se tem um efeito indireto: a resposta que o hospedeiro monta para tentar combater a infecção acaba sendo nociva para ele mesmo. Ele não controla a inflamação e ativa toda essa cascata de forma desenfreada e sistêmica e você acaba consumindo todos esses fatores. Quando o hospedeiro precisa estancar um sangramento, não se tem mais nada porque já foi tudo consumido. Essa depleção de fatores leva à hemorragia e falência de órgãos, devido a formação de trombos. 

 

BN – E o que levou o Laboratório Especial de Desenvolvimento de Vacinas – Centro de Biotecnologia a se debruçar sobre a leptospira, Ana Lúcia?

Ana Lúcia – Nós começamos a estudar a leptospira porque sequenciamos o genoma de uma estirpe que causa a leptospirose severa. Você pode ter  leptospirose subclínica, a mediana e a severa, que apresenta múltiplos focos hemorrágicos, inclusive a Síndrome Hemorrágica Pulmonar, que é gravíssima e pode causar a morte em 48 horas. Não está claro quais são os mecanismos associados aos focos hemorrágicos porque devem ter muitos. Esse mecanismo estudado na tese, provavelmente, é apenas um deles. Nós e outros grupos tínhamos visto que algumas proteínas de superfície que estariam em contato com os componentes do hospedeiro, se ligavam ao fibrinogênio e impediam que essa reação [formação de tampões e o processo de coagulação] acontecesse. Aí, pensamos “tudo bem que a proteína faça isso, mas e a bactéria?” Se a bactéria não faz, não tem sentido!” E nós também queríamos testar as nossas proteínas. Temos várias aqui no laboratório. Então, nós começamos a fazer os estudos com as leptospiras saprófitas (que não são patogênicas), as patogênicas e as virulentas, estas últimas capazes de causar a leptospirose severa. Vimos essa ligação com o fibrinogênio e o impacto que poderia ter no sistema de coagulação. Aí, o Luís quis saber se as bactérias poderiam também agir sobre a trombina e daí derivaram todos esses estudos da tese dele. 

 

BN – E agora que vocês entendem melhor um dos fatores que permite à leptospira interferir na coagulação, isso abre portas para a sugestão de tratamentos?

Ana Lúcia - Na verdade, a tese esclareceu um mecanismo que pode estar atuando e causando esses focos hemorrágicos. Com certeza, deve haver outros que levem a isso, que nós ainda não sabemos, mas algo que observamos foi que a perda de fatores de coagulação por conta da inflamação pôde ser atenuada com o uso de anti-inflamatórios em modelo animal, o que pode vir a ser uma nova terapia no tratamento dos pacientes. 

 

BN – Vocês chegaram a testar o uso de anti-inflamatórios?

Luís Guilherme – Nós temos um trabalho em colaboração com a Faculdade de Medicina Veterinária da USP. Lá, existem algumas estirpes de leptospiras que quando nós utilizamos para infectar os animais (o estudo utilizou hamsters), eles produzem focos hemorrágicos. Com outras, os animais não sangram tanto. Então, nós lançamos mão destas estirpes distintas. Nós observamos que a estirpe mais hemorrágica é a que causa mais inflamação e os animais que têm mais hemorragia têm mais consumo dos fatores de coagulação, mostrando que há um desbalanço. Então, nós quisemos entender se seria possível diminuir o consumo excessivo de fatores. Nós vimos que era possível. Quando se administra anti-inflamatório logo após a infecção, os animais têm menos hemorragia, menos consumo desses fatores e eles sobrevivem por mais tempo. Se você não dá anti-inflamatório, eles morrem em dez dias; com o anti-inflamatório, eles morreram em 15. Morreram, sim, mas sem as hemorragias. Isto, mais uma vez, reforça a natureza multifatorial da leptospirose.

 

BN – Então, o estudo está ajudando a encontrar um tratamento?

Luís Guilherme – Sim, novas terapias. Teve um médico em uma reunião científica, que veio falar comigo há dois anos, quando apresentei um pôster sobre essa pesquisa. Ele me disse que, na prática, quando o paciente tem muita hemorragia em UTI, as equipes médicas têm dado anti-inflamatórios, com base em alguns trabalhos. Antes já existia um indicativo de que fosse uma coagulação disseminada que tem muita relação com a inflamação, então quando tinha casos de muita hemorragia, eles administravam anti-inflamatório. 

Ana Lúcia – O estudo esclarece um pouco porque o anti-inflamatório é importante e é uma maneira de você intervir no processo. 

Luís Guilherme – Uma vez eu apresentei este trabalho em uma disciplina do Programa de Biotecnologia e fui questionado se quando houver quadro de leptospirose severa, seria bom ministrar anti-inflamatório. E eu respondi que o nosso estudo trabalhou com modelo animal, mas que existe um indicativo de que, sim, dependendo da manifestação. Quando há uma inflamação, é sempre uma faca de dois gumes. Ao mesmo tempo que você precisa dela, ela tem que ser muito controlada. A resposta imune precisa ser montada e quem orquestra toda a montagem da resposta imune é a inflamação. Mas, depois se você não controla essa inflamação, você ativa tudo isso de maneira descontrolada. 

 

BN – Quanto tempo a tese consumiu até ser concluída?

Luís Guilherme – Foram em torno de três anos e meio. Fiquei fora seis meses nesse período para aprender algumas outras técnicas não diretamente relacionadas, mas que eu apliquei. 

 

BN – E como foi para você,  Ana Lucia, receber a notícia sobre o prêmio?

Ana Lucia –No ano passado o Luís tinha se inscrito, mas ele ficou em segundo lugar. O programa só indica uma tese para a USP. Esse ano, ele que foi o indicado e  ganhou. Eu acho que ele é muito merecedor. Nós sempre esperamos o sucesso, mas como tem muitos bons alunos, entendemos que a competição é acirrada. Mas ele sempre foi muito dedicado, trabalha bem no nosso laboratório, ajuda a tocar outros projetos, e a co-orientar outros estudantes. Foi muito legal!

 

BN – Ficou orgulhosa do pupilo?

Ana Lucia– Ah, sim, muito, sem dúvida! Aliás, preciso dizer que sou muito orgulhosa de todos os meus pupilos (rs)

 

BN – E quais serão seus próximos passos, Luís?

Luís Guilherme – Vou tentar agora, nos próximos meses, ir para fora do Brasil para finalizar alguns experimentos do meu Pós-Doutorado. Estou iniciando meu terceiro ano no Pós-Doutorado, e mudei um pouquinho de área: estou trabalhando com a manipulação genética da bactéria. Publicamos já um trabalho bem legal. Desenvolvemos o que há de mais novo em silenciamento gênico em Leptospira. A ideia agora é avançar ainda mais nesses estudos. Para você poder entender quais as proteínas que a bactéria precisa para poder causar a doença, o ideal é você ter uma ferramenta para silenciar um gene específico e ver se a bactéria para de causar a doença. Se ela para de causar a doença quando você tira ou silencia um gene, aquele gene codifica uma proteína muito importante para ela e quando você afunila quais são essas proteínas muito importantes para as bactérias, isso facilita o racional para a vacina. Então, por exemplo, se você descobre que retirando as proteínas x,y,z, a bactéria para de causar a doença, então, podemos juntar essas proteínas x,y,z para fazer uma possível vacina. 

 

BN – E para a formação, como é essa experiência tão especifica em leptospira?

Ana Lucia– Embora seja específico de leptospira e leptospirose, o Luís ganhou esse prêmio na categoria multidisciplinar. Não é porque ele estuda leptospira que ele não vai conseguir fazer outros estudos em outros laboratórios. Pelo contrário, aqui nós fazemos biologia molecular, química de proteína, acaba-se fazendo um pouco de imunologia também. Então, nós lidamos com várias disciplinas. Quem sai daqui tem condição de trabalhar em varias áreas. Hoje tem outro pós-doc no laboratório fazendo estrutura de nossas proteínas, que são ainda desconhecidas. Ele está desvendando a estrutura tridimensional de várias proteínas que estudamos no laboratório. São diferentes disciplinas com as quais o aluno têm de se envolver para poder tocar os projetos. Os alunos que fazem Iniciação Científica em nosso laboratório sempre relatam que aprenderam muito no período que trabalharam aqui. 

Luís Guilherme – É fascinante estudar leptospira. É muita coisa diferente que ainda temos para explorar. 

 

(por Adriana Matiuzo)